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Sep 15, 2023Sep 15, 2023

Nature Communications 13권, 기사 번호: 7962(2022) 이 기사 인용

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페니실린 결합 단백질(PBP)의 d,d-트랜스펩티다제 활성은 펩티도글리칸 중합을 차단하는 β-락탐 항생제의 잘 알려진 주요 표적입니다. β-락탐에 의한 박테리아 사멸은 원인과 결과를 해결하기 어려운 복잡한 하류 반응을 포함합니다. 여기에서는 β-락탐에 민감하지 않은 l,d-transpeptidase에 의한 PBP의 기능적 대체를 사용하여 활발하게 분열하는 박테리아에서 β-락탐에 의한 PBP 불활성화 효과를 완화하는 데 필수적인 유전자를 식별합니다. 이 접근법에 의해 확인된 179개의 조건부 필수 유전자의 기능은 펩티도글리칸 중합을 위한 l,d-트랜스펩티다제 파트너를 훨씬 넘어 스트레스 반응 및 외부 막 중합체의 조립에 관여하는 단백질을 포함합니다. β-락탐의 예상치 못한 효과에는 외막을 펩티도글리칸에 연결하는 지질단백질 매개 공유 결합의 손실, 효과적인 펩티도글리칸 가교에도 불구하고 세포 외피의 불안정화, 외막의 투과성 증가 등이 포함됩니다. 후자의 효과는 β-락탐의 작용 방식이 외막을 통한 자체 촉진 침투와 관련이 있음을 나타냅니다.

대장균과 같은 그람 음성 박테리아는 세포질의 팽압(세포벽 펩티도글리칸)을 유지하고 영양분, 폐기물 및 독성 화합물(내막과 외막)에 대한 선택적 화학적 장벽 역할을 하는 다층 외피를 가지고 있습니다. .1a)1. 단백질, 펩타이드, 글리칸 및 지질 부분을 포함하는 여러 폴리머는 봉투의 기계적 특성과 수송 기능을 보장합니다. 브라운 지단백질을 통해 외막에 공유결합으로 연결된 펩티도글리칸(PG)은 이당류-펜타펩타이드 단위에서 중합된 거대한 그물 모양 거대분자(약 109 Da)입니다(그림 1b). 글리코실트랜스퍼라제는 이당류 사이의 β-1,4 글리코시드 결합 형성을 촉매하여 글리칸 사슬을 형성하고 이후 트랜스펩티다제에 의해 서로 가교됩니다(그림 1c). 후자의 효소인 d,d-트랜스펩티다아제는 β-락탐 항생제의 필수 표적이기 때문에 페니실린 결합 단백질(PBP)이라고도 합니다. 펩티도글리칸 중합의 경우, PBP는 펜타펩티드 줄기의 d-Ala4-d-Ala5 말단과 상호작용하고(따라서 d,d 지정) d-Ala4와 활성 부위 Ser 잔기 사이에 공유 결합을 형성하며 동시에 d가 방출됩니다. -Ala5. 다음 단계에서 생성된 아실-효소는 두 번째 기질, 가장 흔히 테트라펩타이드 줄기와 반응하여 PBP가 동시에 방출되면서 4 → 3 교차 결합된 Tetra-Tetra 이량체를 형성합니다(그림 1c, 보충 그림 1c). S1a)2. 스캐폴딩 단백질 및 엔도펩티다아제와 협력하여 d,d-트랜스펩티다아제는 글리칸 가닥이 확장되는 PG 그물형 거대분자에 삽입되도록 중재하여 박테리아 모양을 결정하고 전체 세포 동안 세포질의 삼투압에 대한 기계적 장벽을 보장합니다. 사이클3,4,5,6,7.

a 봉투는 내부(IM, 회색) 및 외부(OM, 검정색) 막으로 구성됩니다. 펩티도글리칸(PG, 파란색)은 박테리아 세포의 삼투압 보호를 보장합니다. IM은 주로 인지질(PL)로 구성된 지질 이중층입니다. OM은 비대칭 지질 이중층입니다. 내부 전단지는 장내 세균 공통 항원(ECAPGL)으로 대체된 지질다당류(LPS)와 포스파티딜글리세리드의 외부 전단지와 PL로 구성됩니다. b PG 서브유닛(GlcNAc, N-아세틸-글루코사민, MurNAc, N-아세틸-무라믹산)의 구조. c PG는 짧은 펩타이드 줄기(색이 있는 원)로 서로 교차 연결된 글리칸 사슬(청색-보라색 다각형)로 만들어진 그물 모양 거대분자입니다. PBP는 아실 기증자 줄기의 4번째 위치와 수용체의 3번째 위치를 연결하는 4 → 3 교차 결합의 형성을 촉매합니다. LDT 계열의 두 구성원(YcbB 및 YnhG)은 3 → 3 교차 결합 형성을 촉매합니다. 3개의 LDT(ErfK, YbiS 및 YcfS)는 브라운 지질단백질(Lpp)을 PG에 고정합니다. PG 기증자 줄기의 3번째 위치에 있는 DAP를 Lpp의 Arg-Lys 말단에 연결하면 OM과 PG 사이에 공유 연결이 제공됩니다. PG-Lpp 링크는 YafK LDT46,47에 의해 가수분해됩니다. d 세프트리악손 없이 성장한 균주 BW25113(ycbB, relA')의 무로펩티드의 rpHPLC 프로필. MurNAc-GlcNAc β-1,4 결합을 절단하는 무라미다제로 PG를 분해하여 얻은 단편으로부터 구조가 추론됩니다. e 질량 분석 분석에서 추론된 무로펩티드의 구조. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>

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