SMC5/6 복합체에 의한 후성유전적 침묵은 HIV를 매개합니다

Sep 15, 2023

자연 미생물학 7권, 페이지 2101–2113(2022)이 기사 인용

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바이러스 진입 및 역전사 후 통합에 실패한 HIV-1 프로바이러스는 후성유전학적으로 침묵하지만 기본 메커니즘은 불분명한 상태로 남아 있습니다. 게놈 차원의 CRISPR/Cas9 녹아웃 스크린을 사용하여 우리는 호스트 SMC5/6 복합체가 이 후성유전적 침묵에 필수적인 것으로 식별했습니다. 우리는 SMC5/6이 통합되지 않은 염색질화된 HIV-1 DNA에 결합한 다음 SUMOylate함을 보여줍니다. SMC5/6 구성 요소 NSMCE2(SUMO E3 리가제)의 점 돌연변이 유발 또는 SUMOylation 억제제 TAK-981을 사용하여 SUMOylation을 억제하면 후성적 침묵을 방지하고 통합되지 않은 HIV-1 DNA에서 전사를 가능하게 하며 인테그라제가 결핍된 DNA의 복제를 복구합니다. HIV-1. 마지막으로, 우리는 SMC5/6 복합체 발현을 차단하거나 SUMOylation 활성을 억제하면 CD4+ T 세포주와 일차 인간 T 세포 모두에서 잠복 HIV-1 감염의 확립을 억제한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리의 데이터는 SMC5/6 복합체가 통합 전에 통합 능력이 있는 HIV-1 프로바이러스를 후생적으로 침묵시킴으로써 HIV-1 잠복기의 확립을 중재하는 데 직접적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

프로바이러스 DNA를 숙주 세포 게놈에 통합하는 것은 프로바이러스 전사 및 복제1,2에 필수적인 레트로바이러스 수명 주기의 정의적인 특징입니다. 인테그라제(IN) 억제제는 HIV-1 복제를 강력하게 억제합니다3. 기능적 IN이 없는 경우, 통합되지 않은 HIV-1 프로바이러스는 히스톤 H3의 라이신 9의 트리메틸화(H3K9me3)를 비롯한 억제성 후성유전적 표시를 축적하고 H3 아세틸화(H3Ac)4,5와 같은 활성화 표시가 고갈됩니다. 통합되지 않은 HIV-1 DNA 전사의 후생적 침묵은 아마도 외부 DNA에 대한 숙주 방어를 나타내는 반면, 이 효과를 중재하는 기본 메커니즘과 세포 요인은 불완전하게 정의되어 있습니다6,7.

쥐 백혈병 바이러스(MLV)의 경우 게놈 화면을 통해 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체의 구성 요소와 DNA 결합 단백질 NP220이 통합되지 않은 MLV DNA 침묵에 중요한 것으로 확인되었습니다8. 그러나 후속 연구9,10에서는 통합되지 않은 HIV-1을 침묵시키는 데 있어 HUSH 복합체 또는 NP220의 역할을 감지하지 못했습니다. 최근에는 HIV-1 Vpr 단백질에 의해 하향조절되는 것으로 밝혀진 1,217개의 인간 유전자에 대한 화면에서 염색체(SMC) 5/6 복합체의 구조적 유지 구성 요소인 SMC5/6 복합체 국소화 인자 2(SLF2)가 중요한 것으로 확인되었습니다. 통합되지 않은 HIV-1 DNA 침묵을 위해. 이 화면은 또한 SMC5 및 6과 4개의 SMC5/6 관련 단백질을 포함하여 SMC5/6 복합체의 6개 다른 구성 요소가 염색체 요소 1~4(NSMCE1-4)의 비구조적 유지를 나타냈지만 SMC5/6은 그렇지 않음을 보여주었습니다. 6개 관련 인자 SLF1은 또한 통합되지 않은 HIV-1 DNA9의 후성유전학적 침묵에 중요했습니다. 주목할 점은 SMC5/6 복합체는 이전에 B형 간염 바이러스(HBV) 비구조 단백질 HBX에 의해 분해되는 것으로 나타났으며, HBX가 없는 경우 에피솜 HBV DNA도 후성유전적으로 침묵됩니다11,12. 따라서 SMC5/6 복합체는 염색체 복제, 재조합 및 복구13에 참여할 뿐만 아니라 침입성 바이러스 DNA를 침묵시킬 수도 있습니다. 여기에서 우리는 SMC5/6 복합체가 잠복 HIV-1 감염의 확립을 중재하는지 여부를 확인하려고 했습니다.

통합되지 않은 HIV-1 DNA를 전사적으로 침묵시키는 요인을 확인하기 위해 우리는 인간 CD4+ T 세포주 CEM-SS에서 게놈 전체 CRISPR/Cas9 녹아웃 스크린14을 수행했습니다. 우리는 19,114개의 인간 유전자를 표적으로 하는 ~80,000개의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하는 렌티바이러스 라이브러리를 사용하여 Streptococcus pyogenes Cas9를 발현하는 CEM-SS 서브클론을 형질도입했습니다. 7일 후, 우리는 env의 결실, IN의 비활성화 D64V 돌연변이16 및 nef 대신 녹색 형광 단백질(GFP) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 HIV-1 유도체인 IN-NL-GFPΔEnv10으로 이들 세포를 감염시켰습니다. 이 바이러스는 vpr을 포함한 다른 6개 HIV-1 유전자의 온전한 복사본을 보유합니다. 감염 후 48시간(hpi)에, GFP+ 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 수집하고, (폴리머라제 연쇄 반응) PCR로 sgRNA를 회수한 다음, 동일한 렌티바이러스 벡터에 클로닝했습니다. GFP+ 세포에 대한 3회 선택 후, sgRNA의 서열을 분석하고 시작 sgRNA 라이브러리와 비교하여 농축 여부를 분석했습니다. 그림 1a의 화산 플롯에서 볼 수 있듯이 우리는 16배 이상 풍부하고 P 값이 0.0005 미만인 9개의 유전자를 식별했습니다. 여기에는 추가로 분석되지 않은 3개의 세포 표면 수용체(LY9, OR52N2 및 SSTR2)와 1개의 운동 단백질(MYO1B)이 포함되었습니다. 이 분석은 또한 SMC5/6 복합체의 알려진 8개 구성 요소 중 4개, 즉 SMC5, SMC6, SLF1 및 NSMCE3과 DNA 복구 단백질 SWI5를 복구했습니다(그림 1a).

16 and P value <0.0005 (delineated by the red lines) are labelled. Briefly, P values for individual sgRNAs were calculated using a negative binomial (NB) model, then sorted sgRNA P values were used to calculate FDR-corrected P values for individual genes using the robust rank aggregation (αRRA) algorithm in MAGeCK-VISPR50,51. Members of the SMC5/6 complex are in green (FDR-corrected P values: SMC5 = 7.8 × 10−7, SMC6 = 0.00033, NSMCE3 = 0.00010, SLF1 = 0.00017). b, Flow cytometry of WT CEM-SS cells and the indicated clonal knockout cell lines at 2 dpi with an IN− NL-GFPΔEnv reporter virus at an MOI of ~0.3. A representative experiment from 3 biological replicates is shown. c,d, Flow cytometry of WT (c) or ΔSMC5 CEM-SS (d) cells at 2 dpi with IN+ NL-GFPΔEnv reporter virus at an MOI of ~0.3. Representative experiments from 3 biological replicates are shown. e–h, Time course of the infection of the parental CEM-SS Cas9 cells, or the ∆SMC5 and ∆SLF2 CEM-SS clones with IN+ or IN− NL-NLuc. e, Live cells. f, Virally encoded NLuc expression. g, Total HIV-1 DNA. h, Total HIV-1 RNA expression quantified at the indicated dpi. All IN+ HIV-1-infected cultures died from viral cytopathicity by 7 dpi. DNA and RNA levels were quantified by qPCR and normalized to IN+ HIV-1-infected CEM-SS Cas9 cells at 1 dpi, which was set to 1. Mean ± s.d. of 3 biological replicates./p>

108 colonies when plated to ensure each sgRNA in the library was covered ~1,000× on average. These colonies were collected and the pooled library plasmids extracted using Maxiprep columns (Zymo)./p>

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